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高效液相色谱法测定烟用接装纸中水溶性着色剂

  • 李响丽
  • 范多青
  • 李超
  • 张承明
  • 王璐
  • 陈建华
  • 王岚
  • 郭丽娟
  • 刘秀明
云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南昆明,650231

中图分类号: TS761.2

最近更新:2023-12-21

DOI:10.11980/j.issn.0254-508X.2023.12.013

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摘要

本研究建立了同时测定烟用接装纸中诱惑红、苋菜红、酸性红、胭脂红、赤藓红、喹啉黄、靛蓝、亮蓝、柠檬黄、日落黄10种着色剂的高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-PDA)方法。样品以甲醇/乙腈/水为溶剂,微波辅助提取10种烟用接装纸中的水溶性合成着色剂。通过单因素与正交实验结合的方法研究了提取溶剂、微波功率、提取时间对提取效率的影响。结果表明,溶剂为甲醇/乙腈/水=1∶1∶3(体积比),微波功率300 W、提取时间3 min、固液比为1∶100时,着色剂提取效果最佳。目标化合物在15 min内分离度良好,能达到基线分离,在0.5~20.0 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数均大于0.999,回收率为92.6%~100.3%,相对标准偏差(n=5)为0.5%~6.7%;方法检出限为0.95~3.21 μg/g,定量限为3.16~10.72 μg/g。该方法能同时快速分析烟用材料中10种水溶性合成着色剂的含量,为卷烟安全评价提供技术支撑。

随着人们生活理念和生活方式的进步,以及年轻消费群体的崛起,烟草市场也在发生重大变化。色彩是影响产品感官性状的重要因素之一,也是给予消费者的第一视觉印象。烟用接装纸是以接装纸原纸为基材,通过印前设计、印刷加工和印后处理等工序,制造的卷烟专用纸[

1]。目前,部分烟用接装纸利用呈色香料构建与卷烟风格特征的关系,促使卷烟产品消费行为产生视觉、嗅觉和味觉的联觉诱导。烟用材料的安全性一直是行业和卷烟工业企业关注的重点。目前,针对重点关注的如甲醛、溶剂残留、无机元素等安全卫生指标,已有明确的限量规定。为从源头上管控好烟用材料使用原材料,非常有必要对与嘴唇有接触的烟用接装纸着色剂进行分析。本研究针对烟用接装纸中允许添加的10种食品级常用合成着色剂建立分析方法,可为卷烟安全性评价提供技术支撑。

目前针对不同物质中合成着色剂的分析方法较[

2-5],不同的研究对象处理方式不[6-9],常用的前处理方法有固相萃取小柱吸附法、超声提取法和聚酰胺吸附法等。GB 5009.35—2016所推荐的前处理方法是聚酰胺吸附法,而超声提取法是SN/T 4457—2016所推荐的着色剂前处理方法,这2种前处理方法在饮料合成着色剂的液相色谱分析中得到广泛应用,各有优缺点。于辉等[10]对比研究了GB 5009.35—2016和SN/T 4457—2016的样品前处理方法,采用超声提取法和聚酰胺吸附法分别对饮料中的着色剂进行高效液相色谱分析,对美年达饮料中柠檬黄、胭脂红、日落黄的含量进行测定,结果表明,这2种前处理方法的检测结果无显著差异。采用聚酰胺吸附法处理的样品,虽然杂质干扰峰少,基质干净,但操作较为复杂,仅适用于检测小批量样品。但聚酰胺吸附法不适于赤藓红样品,这是因为不同于其他苯磺酸钠结构的合成着色剂,赤藓红为苯甲酸钠结构,而聚酰胺吸附材料具有强极性,可利用分子间氢键吸附,适用于水溶液中极性物质的提取或层析分离,也可用于非极性溶液中提取极性物质,因此,采用聚酰胺吸附法时赤藓红损失较大,回收率[11]。超声提取法操作简单、成本低廉,大大缩短了分析时间,适用于大批量样品的定量检测,但存在其他杂质峰的干扰。

微波辅助提取的工作原理是利用电磁场的作用,使半固体或固体物质中的某些有机物与基体实现有效分离,并保留分析对象的原本状态。超声波产生的强烈振动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,能够加速有效成分进入溶剂,另外,超声波的次级效应,如机械振动、扩散、乳化击碎效应等也会加速有效成分的扩散释[

12],超声波作为一种新的能量形式,广泛应用于环境化学、有机合成、生物化学及纳米材料制[13]等。因此,本研究以10种水溶性着色剂为目标产物,通过微波辅助的提取方法,建立了一种高效液相色谱法快速分析水溶性着色剂的方法。

1 实 验

1.1 材料与试剂

材料:接装纸材料取自市场在售具有颜色的卷烟样品。

试剂:甲醇(色谱纯,Meck,德国);乙腈(色谱纯,Meck,德国);乙酸铵(分析纯,广东汕头市西陇化工厂);10种合成着色剂标准品,全部购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司,详细信息见表1

表1  10种合成着色剂标准品样本信息
Table 1  Sample information of the 10 synthetic colorant standards
中文名称CAS号纯度/%分子质量分子式
亮蓝 3844-45-9 ≥93.4 792.85 C37H34N2Na2O9S3
靛蓝 860-22-0 ≥89.0 262.26 C16H8N2Na2O8S2
胭脂红 2611-82-7 ≥89.8 565.51 C20H11N2Na3O10S3
赤藓红 16423-68-0 ≥91.0 897.87 C20H6I4O5Na2H2O
诱惑红 25956-17-6 ≥80.0 496.42 C18H14N2Na2O8S2
苋菜红 915-67-3 ≥92.6 604.47 C20H11N2Na3O10S3
酸性红 3567-69-9 ≥87.4 502.43 C27H29N2NaO7S2
柠檬黄 1934-21-0 ≥95.5 534.36 C16H9N4Na3O9S2
日落黄 2783-94-0 ≥90.5 452.37 C16H10N2Na2O7S2
喹啉黄 8004-92-0 ≥90.2 477.38 C18H9NNa2O8S2

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪(HPLC,检测器配置Waters 2998二极管阵列),美国Waters公司;Agilent HC-C18(2) (150 mm×4.6 mm,5 μm)。Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司,电阻率>18 MΩ)。AB204-S电子分析天平(精确至0.0001 g,瑞士Mettler-Toledo公司)。微波辅助萃取仪(MARSX,CEM公司);高速离心机(TDL-5-A,上海安亭科学仪器厂,最大转速10000 r/min)。0.45 μm水相针式过滤器。

1.3 实验方法

1.3.1 微波辅助提取条件优化

采用微波辅助提取的方法,以着色剂总含量为考察指标,研究不同提取溶剂、液料比、微波功率、提取时间等提取条件对提取率的影响。在单因素实验基础上,以微波功率(P)、提取时间(T)、固液比(S,g∶mL)、萃取混合液浓度(E,水∶甲醇∶乙腈,体积比)为考察因素,着色剂总含量提取率为考察指标,采用正交表L9(34) 进行正交实验设计,确定最佳的提取条件,正交实验因素水平如表2所示。

表2  正交实验因素水平
Table 2  Factor levels of orthogonal experiment
水平P/WT/minSE
1 300 1 1∶50 8∶1∶1
2 400 3 1∶100 4∶3∶3
3 500 5 1∶150 3∶1∶1

1.3.2 标准溶液配制

首先准确称取柠檬黄、胭脂红、苋菜红、日落黄、亮蓝、诱惑红、酸性红、靛蓝、赤藓红、喹啉黄10种合成着色剂各25 mg(精确至0.1 mg)于25 mL的容量瓶中,采用水∶甲醇∶乙腈(3∶1∶1,体积比,下同)定容,配置成浓度为1.0 mg/mL的10种单一标准储备液;分别移取单一标准储备液2.5 mL于50 mL容量瓶中混合后,用水/甲醇/乙腈稀释定容得到浓度为50.0 μg/mL的混合标准储备溶液;分别移取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL的混合标准溶液到10 mL容量瓶中,用水/甲醇/乙腈稀释定容,分别制得浓度为0.5、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL的合成着色剂的系列标准工作溶液。

1.3.3 样品前处理

准确裁切长度200 mm、宽度40 mm的烟用接装纸样品(应包含1个单边),将裁剪下来的试样剪成约0.5 cm× 0.5 cm的碎片,混合均匀,置于干净的密封袋中待用,每个试样不少于5 g。准确称取接装纸试样1.0 g(精确至0.1 mg)置于50 mL萃取罐中,加入20 mL水/甲醇/乙腈溶液加盖密封,采用微波辅助提取(微波功率为300 W,提取时间3 min),提取物的上清液经0.45 μm水相滤膜过滤,制得待测液。

1.3.4 样品HPLC分析

采用HPLC-PDA对待测液进行分析,外标法进行定量。色谱柱为Agilent色谱柱,柱温30 ℃,进样量10.0 μL,流动相总流速为1.0 mL/min。吸收波长为各目标物的最大吸收波长。流动相A相为0.02 mol/L乙酸铵水溶液,B相为乙腈。具体梯度洗脱程序如表3所示。

表3  梯度洗脱程序
Table 3  Gradient elution procedure
时间/min流动相A/%流动相B/%
0 95 5
10.0 55 45
11.0 55 45
11.1 5 95
13.0 5 95
13.1 95 5
16.0 95 5

2 结果与讨论

2.1 单因素实验分析

对微波辅助提取条件进行单因素优化,改变单个因素,其他条件同1.3.3,分别对提取溶剂、提取时间、微波功率及固液比进行优化,着色剂总含量结果如图1所示。图1(a)为不同提取溶剂水、水/甲醇(体积比9∶1,以下同)、水/乙醇(体积比9∶1,以下同)、水/甲醇/乙腈与目标物总含量的关系图。实验分析的10个目标物均易溶于水和甲醇,故采用水和醇溶液作为提取溶剂,另外考虑流动相为乙腈,因此比较了水、水/甲醇、水/乙醇、水/甲醇/乙腈作为提取溶剂对着色剂进行提取的效果,结果表明,水/乙醇作为溶剂提取效率较低,其中对苋菜红影响最大,水和水/甲醇作为提取溶剂结果差异不大,而水/甲醇/乙腈作为溶剂时,2个样品中赤藓红提取率明显升高,赤藓红为苯甲酸钠结构,相对其他着色剂其极性较弱,更易溶解于比水极性更弱的乙腈。因此,实验选择水/甲醇/乙腈作为提取溶剂。不同提取时间(1、3、5、10 min)与着色剂总含量的结果如图1(b)所示。从图1(b)可以看出,当提取时间超过3 min后,目标物提取量基本不再发生变化。图1(c)为不同微波功率(300、400、500、600 W)与着色剂总含量的关系。结果表明,不同微波功率下目标物提取量基本没变化。在上述优化条件的基础上,称取接装纸样品1.0 g,分别加入10、20、30 mL提取溶剂,考察不同料液比检测结果(图1(d)),从图1(d)可以看出,料液比为1∶50时,着色剂提取不完全。

图1  总着色剂提取结果比较

Fig. 1  Comparison of the total colorant extraction results

2.2 微波辅助法提取着色剂的最佳工艺

采用微波辅助提取的方式,通过L934)正交实验研究了不同PTSE等因素对提取效果的影响。正交实验设计及结果见表4。由表4可知,使用微波辅助法提取时,影响提取效果的因素顺序为:P>E>T>S,微波功率对提取率的影响最大。最优化工艺为:P1T2S2E2,即提取微波功率300 W,时间3 min,固液比1∶100,水/甲醇/乙腈=3∶1∶1。

表4  正交L934)实验结果
Table 4  Results of the orthogonal L934) experiments
实验号PTSE着色剂总含量/μg·g-1
1 1 1 1 1 7823
2 1 2 2 2 7969
3 1 3 3 3 7810
4 2 1 2 3 7763
5 2 2 3 1 7822
6 2 3 1 2 7808
7 3 1 3 2 7813
8 3 2 1 3 7810
9 3 3 2 1 7789
k1 7867 7800 7814 7811
k2 7798 7867 7840 7863
k3 7804 7802 7815 7794
R 69 67 26 69

2.3 过滤膜选择

将微波辅助提取的萃取溶液进行过滤处理,研究了聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、尼龙6(Nylon,国产)、尼龙66(进口)、混合纤维素(MCM)针头过滤膜及无过滤膜对水/甲醇/乙腈为萃取溶液的标准混合溶液(5 μg/mL)过滤的影响,结果如图2所示。从图2可以看出,除尼龙过滤膜,其余过滤膜所得结果基本相同,峰面积相对标准偏差(RSD)≤0.09%。有机系滤膜尼龙6(国产)和尼龙66(英国进口)过滤的样品,各峰面积均不同程度的降低,特别是尼龙6对酸性红、赤藓红、喹啉黄及亮蓝吸附较严重,这可能是因为尼龙即聚酰胺,是GB 5009.35—2016中用于着色剂的富集净化的填料,其对各目标物均有不同程度的吸附作用,因此本研究推荐使用水系滤膜PES、PTFE、PVDF作为过滤膜。

图2  不同过滤方式检测峰面积对比

Fig. 2  Comparison of peak areas detected by different filtering methods

2.4 波长扫描

以1.3.4中仪器分析方法,采用二极管阵列检测器在190~800 nm范围内进行全波长扫描,发现10种着色剂在254 nm的波长下均有较强吸收,但实际检测中发现,此波长存在多种物质产生吸收,干扰峰较多,干扰严重,因此,254 nm并不是理想的检测波长。不同着色剂在可见光区有不同的最大吸收波长,在不同着色剂相应的最大吸收波长下进行检测,能够有效避免杂质干扰,增加检测灵敏度。图3为10种着色剂3D扫描轮廓线图,10种着色剂的可见光区最大吸收波长见表5。本研究相应的研究结果采用表5中各种着色剂的最大吸收波长进行。

图3  10种着色剂3D扫描轮廓线图

Fig. 3  3D scan contour plot of ten colorants

表5  10种合成着色剂的检测波长
Table 5  Detection wavelengths of the 10 synthetic colorants
名称检测波长/nm名称检测波长/nm
亮蓝 627 苋菜红 522
靛蓝 612 酸性红 520
胭脂红 511 柠檬黄 427
赤藓红 530 日落黄 486
诱惑红 507 喹啉黄 414,417

2.5 工作曲线、检出限和定量限

配制柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、赤藓红、靛蓝、喹啉黄的混合标准溶液(浓度范围0.5~20.0 μg/mL),以各合成着色剂的浓度(μg/mL)为横坐标,对应的峰面积为纵坐标(喹啉黄4个异构体峰面积合并计算),绘制标准曲线,10种合成着色剂的相关系数(R2)均高于0.999,表明10种目标物在0.5~20.0 μg/mL范围内线性关系良好。标准工作溶液色谱图如图4所示。将最低浓度的标准溶液连续测定10次,3倍标准偏差(S/N=3)作为检出限(LOD),10倍标准偏差(S/N=10)作为定量限(LOQ[

13],具体数据见表6。由表6可知,10种合成着色剂的LOD在0.95~3.21 μg/g,LOQ在3.16~10.72 μg/g。

图4  10种着色剂标准工作溶液的色谱图

Fig. 4  Chromatograms of the standard working solutions of ten colorants

1—柠檬黄 2—苋菜红 3—靛蓝 4—QYNa2Ⅰ 5—胭脂红6—日落黄 7—QYNa2Ⅱ 8—诱惑红 9—酸性红 10—亮蓝11—QYNaⅠ 12—QYNaⅡ 13—赤藓红

表6  标准曲线和检测限
Table 6  Standard curve and limit of detection
合成着色剂保留时间/min回归方程R2LOD/μg·g-1LOQ/μg·g-1
柠檬黄 3.49 y = 46080x + 5443.2 0.9999 0.95 3.16
苋菜红 4.11 y = 37531x + 1505.5 0.9999 2.90 9.68
靛蓝 4.43 y = 40785x + 2360.1 0.9998 2.35 7.84
喹啉黄 5.34,6.37,9.42,9.61 y = 79927x + 6846.3 0.9998 2.22 7.40
胭脂红 5.57 y = 33731x + 2064 0.9999 3.21 10.72
日落黄 5.96 y = 47400x + 2918.6 0.9999 2.53 8.44
诱惑红 6.64 y = 52706x + 2269 0.9999 3.05 10.18
酸性红 8.35 y = 46639x + 2225.4 0.9999 1.40 4.66
亮蓝 8.83 y = 132214x + 8837.9 0.9999 1.07 3.56
赤藓红 9.87 y = 91907x + 4178.3 0.9999 2.51 8.37

注   喹啉黄为喹啉黄二钠盐(QYNa2 Ⅰ、QYNa2 Ⅱ)及喹啉黄一钠盐(QYNa Ⅰ、QYNa Ⅱ)峰面积之和对应浓度绘制标准曲线。

2.6 回收率实验

回收率实验是检验系统误差的方法之一,回收率越好,说明样品在处理过程中损失小,测得的结果越接近实际值,即准确度好。采用空白接装纸样品,以3水平加标方法进行回收率和精密度实验,检测方法回收率与重复性结果见表7。由表7可知,平均回收率在92.6%~100.3%,平均RSD在0.9%~3.8%之间,说明系统误差小,准确度较好。

表7  方法回收率与重复性(n=5)
Table 7  Method recovery rate and repeatability(n=5)
目标物原含量/μg加标量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%平均RSD/%
柠檬黄 0 5 85.2 92.6 1.5 1.4
200 93.6 1.9
400 98.9 0.8
苋菜红 0 5 86.8 95.6 6.7 3.8
200 98.4 3.5
400 101.6 1.3
靛蓝 0 5 91.2 96.7 5.7 3.8
200 97.6 0.9
400 101.3 4.8
胭脂红 0 5 90.2 96.5 1.7 1.4
200 98.9 0.9
400 100.5 1.5
日落黄 0 5 92.5 98.0 1.5 0.9
200 99.1 0.8
400 102.5 0.5
诱惑红 0 5 100.3 99.4 1.7 1.2
200 99.7 0.8
400 98.3 1.0
酸性红 0 5 98.3 100.3 3.1 1.6
200 104.6 1.1
400 97.9 0.5
赤鲜红 0 5 100.8 100.1 1.4 1.0
200 98.0 0.7
400 101.4 0.9
亮蓝 0 5 86.1 94.8 2.3 1.7
200 101.4 2.0
400 96.9 0.7
喹啉黄 0 5 95.3 98.1 2.9 1.9
200 100.5 2.4
400 98.6 0.5

2.7 部分样品分析

取5个不同颜色的烟用接装纸样品,采用本研究方法进行样品处理及着色剂检测,其中2个样品中检出诱惑红和柠檬黄,其含量低于GB 2760—2014中规定的食品最大使用量,其余3个样品未检出。根据前期调研,部分卷烟产品接装纸采用天然着色剂(如番茄红素、红花黄、红曲米等)进行着色,因此未检出合成着色剂。

3 结 论

本研究以10种水溶性着色剂为目标物,采用微波辅助提取接装纸中着色剂,通过对样品前处理方法的优化,对方法的精密度、准确度、回收率进行考察,建立了烟用接装纸中10种水溶性合成着色剂的液相色谱分析方法。

采用以水/甲醇/乙腈(3∶1∶1,体积比)为萃取溶液,微波功率300 W、提取时间3 min、固液比为1∶100,提取10种着色剂,经反相液相色谱法对柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、赤藓红、靛蓝、喹啉黄进行分离分析,使用配有二极管阵列的高效液相色谱仪测定,外标法定量。该方法在0.5~20.0 μg/mL线性范围内,相关系数大于0.999,方法检出限在0.95~3.21 μg/g,方法定量限在3.16~10.72 μg/g;在5、200、400 μg 3个水平进行加标回收实验,回收率在92.6%~100.3%。

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