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纸基微流控芯片原纸的构建及其对颜色信号均匀性的优化研究

  • 李琼阳 1
  • 张雪 1,2,3 ✉
  • 陈伊玉 1
  • 万小芳 1
  • 田君飞 1 ✉
1. 华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640； 2. 中国制浆造纸研究院有限公司，北京，100102； 3. 广东壮丽彩印股份有限公司，广东汕头，515041

中图分类号： TS721+.1

最近更新：2024-05-31

DOI：10.11980/j.issn.0254-508X.2023.05.018

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摘要

为了提高纸基芯片比色检测结果的均匀性，对漂白硫酸盐松木浆进行PFI磨浆处理，制备实验室原纸。与常用于构建纸基芯片的滤纸进行对比，本研究制备的纸基底表现出良好的颜色均匀性。在Fe2+比色检测中，该纸基芯片分析响应在1~75 mg/L范围内线性相关良好（R2=0.9599），检测下限为0.4 mg/L，并成功实现了对实际水样中Fe2+的（半）定量检测。

纸基微流控芯片是近年来兴起的一种在低资源配置条件下的快速检测平台技术，在生物诊断及化学分析等快速筛查检测中具有极大的应用潜力。该芯片主要以丝网印刷、光刻、蜡印等方式在纸张上构建微通道[

1-2]，利用毛细管力实现微量生化流体的定向输送，进而通过比色法、化学发光法、荧光法、电化学法等完成检测分析[2-3]。相较其他方法，比色芯片不依赖专业分析设备，可通过扫描仪、智能手机、相机等电子设备读取颜色强度的变化，获得目标分析物的量化信息，因其价格低廉、适用范围广泛、可远程传输、用户友好的优势被广泛认可。然而，由于纸张多孔且非均质的特性，物质的传输并非总是均匀的，比色检测中普遍存在不均匀色斑，通常呈现“中心颜色浅、边缘颜色深”的现象。Deegan等人[4]最早指出类似现象，提出液滴不均匀蒸发作用诱导的毛细流动是主要成因的观点，并把这种现象称作“咖啡环”效应。Nilghaz等人[5]进一步补充流体在多孔材料中的传输还受孔隙结构影响的观点。为了改善比色的不均匀性，Feng等人[6]采用水热法在纸张表面均匀修饰锌纳米粒子，克服“咖啡环”效应；Liu等人[7]通过在滤纸表面修饰壳聚糖，实现对生物分子的有效固定，从而获取图案化的比色结果，提高了检测灵敏度和用户友好性。

事实上，纸张的定量、厚度、孔隙率等物理特性具有十分宽泛的可调控范围[

8]，纤维长度、粗度、打浆度及浆料配比是原纸性能的重要影响因素[9-11]。陈夫山等人[12]通过改变打浆度等调节原纸结构，实现了纸张白度、抗张强度及吸液高度等性能的调控。在纸基比色检测领域中，不同纸张用于比色检测的表现有着显著的区别[13]。Li等人[14]通过改变纤维种类及配比，探究红细胞在不同结构纸张上的沉积形态；Cao等人[15]通过对纸基的定制化构建，有效减弱了免疫血液学检测中的“咖啡环”现象。Lu等人[16]研究发现提高纤维阵列紧密程度有利于四环素检测颜色信号的均匀分布。因此，调控纸张物理特性能够有效提高纸基芯片的检测性能，制浆造纸工艺技术在纸基快速检测领域仍有较大的发展空间。

本研究提出一种纸基芯片原纸的优化构建方法，通过PFI磨浆工艺提高松木纤维表面的细小纤维数量，增强纤维间的交织作用，进而制备纤维阵列结构紧密的纸基底。随后将该原纸应用于Fe2+的比色检测，进一步考察该纸基底提升比色信号均匀性的效果，并成功完成了水样中Fe2+的（半）定量检测。

1 实验

1.1　材料与仪器

漂白硫酸盐松木浆（以下简称松木浆）由广州某造纸企业提供；Whatman 1级定性滤纸（1#），美国GE医疗生物科学有限公司；六水硫酸亚铁铵、1,10-菲罗啉（邻菲啰啉）、五水硫酸铜、六水氯化镍、氯化钠、氯化钙、无水乙醇，以上均为分析纯，上海麦克林生化有限公司。使用无水乙醇配制邻菲啰啉溶液，使用去离子水配制其他溶液。亚铁离子（Fe2+）溶液现用现配。

Mark V 621 PFI磨浆机，挪威Hamjern Maskin公司；P95587打浆度测试仪，德国PTI公司；RK3AKWT自动纸页成型器，奥地利PTI公司；Morfi Compact纤维分析仪，法国Techpap公司；厚度仪，瑞典L&W公司；SU5000场发射扫描电子显微镜（FESEM），日本日立株式会社；Color Touch PC CTP-ISO白度/残余油墨测定仪，美国Technidyne公司；Perfection V39扫描仪，日本爱普生公司。

1.2　实验方法

1.2.1　纸基芯片的制备

纸基芯片的制备主要包括纤维PFI磨浆处理、原纸抄造和纸基芯片组装等步骤。

取30 g（以绝干浆计）松木浆浸泡4 h，然后疏解5 min以上至纤维均匀分散。调整浆浓至10%左右，使用PFI磨浆机对松木浆进行磨浆处理，并测定浆料打浆度。使用纤维分析仪测定纤维长度、宽度、卷曲指数等参数。将打浆度为50 °SR的浆料调配至合适浓度，并根据ISO 5269/2—1980标准方法抄造定量为80 g/m2的原纸（S50）。将所有原纸置于温度为(23±1) ℃和相对湿度为(50±2)%的环境下平衡水分24 h，然后测定纸张的定量、厚度和白度。

使用金属冲头对原纸/滤纸进行切割，得到数个直径为5 mm的圆形纸片，然后进行纸基芯片的组装：纸基芯片的结构分为2层，上层为圆形纸片，底层为复印胶片，使用双面胶带将上层纸片粘贴在底层胶片上。圆形纸片间相互独立，防止样品相互污染。为方便进行区分，使用滤纸和原纸制备的纸基芯片在本研究中分别表示为1#纸基芯片和S50纸基芯片。

1.2.2　检测条件优化

Fe2+的比色检测基于邻菲啰啉与Fe2+间的络合反应，两者作用产生橘红色络合物，颜色的深浅与Fe2+的浓度相关。通过建立颜色强度与Fe2+浓度的标准曲线，将待测溶液的比色颜色强度值输入标准函数，计算Fe2+的含量。

滴加1.5 μL邻菲啰啉到检测区域后，将纸基芯片置于室温环境下干燥5 min以上，然后滴加1.5 μL Fe2+。孵育合适时间后，使用桌面扫描仪以600 dpi分辨率记录纸基芯片的颜色变化。

（1）孵育时间

比色检测结果受孵育时间的影响：孵育时间过短，比色反应不充分，颜色信息显现不完全，导致较差的分析响应；孵育时间过长，一方面下降的颜色强度降低了检测灵敏度，另一方面也不利于检测现场快速出具分析结果。因此，需要对孵育时间进行优化，选取最利于快速检测的孵育时间。

（2）邻菲啰啉质量浓度

分别配制质量浓度为1、2、3、4 g/L的邻菲啰啉/乙醇溶液，然后测量Fe2+（质量浓度100 mg/L）与邻菲啰啉检测试剂反应后纸基芯片颜色强度的变化。选取产物颜色变化最强烈的邻菲啰啉质量浓度为最优浓度，并进行后续实验。

（3）颜色通道

本研究使用ImageJ®软件提取所记录的芯片颜色变化信息，分别测量红（R）、绿（G）、蓝（B）3个颜色分通道直方图信息，建立与质量浓度相关的标准曲线，选取最优颜色通道，以进行后续数据处理。

1.2.3　颜色均匀性的表征

本研究使用ImageJ®软件对纸基芯片颜色均匀性进行定性及定量分析。使用线段工具框定选区，绘制颜色强度径向分布图。使用矩形工具框定选区，绘制颜色强度平面分布图。颜色均匀性的定量分析，则通过计算选区内各点颜色强度值的相对标准偏差（RSD，%）来表示，具体计算见式(1)，以反映选区内各点颜色的离散程度。

RSD=颜色强度平均值颜色强度标准偏差×100% （1）

2 结果与讨论

2.1　原纸微观形貌和性能分析

本研究未对纤维素表面基团进行化学改性，由于羟基和羧基的存在[

17-18]，原纸保持了亲水特性。分别从纤维微观形态和纸张物理性能2个层面探究了纸张结构对纸基芯片比色信号均匀性的影响。使用纤维分析仪测定了2种纸张纤维质量参数，结果如表1所示。由表1可知，S50纤维的长度和宽度均大于1#纤维的，卷曲指数小于1#纤维的，即S50纤维是长而挺的纤维。

表 1  纸张物理参数
Table 1  Physical properties of papers
纸样纤维宽度/μm纤维加权平均长度/mm纤维卷曲指数/%透气度/L·min-1松厚度/cm3·g-1白度/%
1# 23 896 16 8.3 1.5 91
S50 29 1338 12 0.1 1.1 84

使用FESEM对纸张表面微观形貌进行表征，如图1所示。由图1可知，经PFI磨浆处理后纤维分丝帚化，表面暴露许多细小纤维分支。当纤维表面细小纤维较多时，纤维间接触点密度较高，相互交织所构成的纤维网络则更为紧密。从表1可知，S50的透气度和松厚度远小于1#的，这表明S50孔隙结构较少，其纤维网络结构也比1#的紧凑得多。此外，白度测量数据显示，S50的白度比1#的低7个百分点，这是由于细小纤维及紧密结构减少了纤维网络结构对光的散射[

19]。白度主要影响裸眼观测及扫描仪测量背景，但由于在本研究中变化幅度较小，故S50仍是良好的比色背景（白色）。

图1  1#和S50纸张的FESEM图

Fig. 1  FESEM images of 1# and S50 papers

2.2　Fe2+检测优化

在即时快速分析中，纸基芯片的孵育时间与芯片工作效率相关。检测试剂邻菲啰啉的质量浓度则是影响灵敏度的主要因素。故本研究对Fe2+检测条件进行了一系列优化，优化结果如图2所示。

图2  Fe2+检测实验条件优化

Fig. 2  Optimization of Fe2+ detection experimental conditions

取孵育时间为3~15 min，每隔2 min记录分析显色结果。从图2(a)可知，孵育时间进行到5 min时，比色颜色强度达到峰值。随着孵育时间的推移，比色颜色强度下降，即颜色信号开始减弱，这是由于有色络合物在空气中可能发生氧化或降解反应。因此，选择孵育时间5 min为最佳孵育时间。从图2(b)可知，在同等Fe2+质量浓度条件下（10 mg/L），随着邻菲啰啉质量浓度的提高，比色颜色强度值逐渐提高，因此，选取邻菲啰啉质量浓度4 g/L为后续实验检测试剂质量浓度。从图2(c)可知，通过B通道提取的颜色强度信息与Fe2+质量浓度的校准曲线具有更高的斜率，即B通道分析方法具有更高的灵敏度，因此选取B通道为最佳颜色分析通道。

2.3　纸基芯片在Fe2+检测中的应用

2.3.1　颜色均匀性

为充分说明比色信号均匀性的提升，本研究从实际测量结果、颜色信号在径向和平面上的分布、颜色强度相对标准偏差4方面分析S50纸基芯片的优化效果，具体见图3。与1#纸基芯片（图3(a)）相比，可裸眼观察到通过造纸工艺优化的S50纸基芯片（图3(b)）表现出更好的颜色均匀性。同时，径向和平面颜色强度分布图也表明颜色产物在S50纸基芯片上分布更加均匀。通过造纸工艺优化的S50纸基芯片，其颜色强度RSD为(5.9±0.5)%，相较1#纸基芯片下降了63.6%，表明S50纸基芯片中各点颜色强度波动降低，纸基芯片检测的可信度得到提升。颜色均匀性提升的原因主要在于孔隙结构影响流体在纤维网络结构中的传输速率。当孔隙结构少且复杂时，纤维网络结构阻碍了流体向边缘区域的快速扩散，毛细流速下降，溶质在纸张上的沉积更加均匀。

图3  Fe2+比色检测在1#纸基芯片及S50纸基芯片上的颜色均匀性

Fig. 3  Color uniformity of Fe2+colorimetric detection on 1# paper-based chip and S50 paper-based chip

注   1为实物图像； 2为颜色强度径向分布图； 3为颜色强度平面分布图。

2.3.2　纸基芯片的分析响应

检测方法的分析响应性能主要包括线性范围、灵敏度、检测限等响应参数。在本研究中，通过建立响应曲线，并进行离子选择性、抗干扰及加标回收实验，来验证通过造纸工艺优化的纸基芯片在实际样品检测中的响应性能。

图4为Fe2+与邻菲啰啉络合产物在S50纸基芯片上颜色强度随Fe2+质量浓度（1~500 mg/L）变化趋势及其线性标准曲线（1~75 mg/L）。由图4可知，Fe2+检测在S50纸基芯片上的线性范围可达1~75 mg/L，线性方程为y=1.1x+5.8，线性相关系数R2为0.9599（n=3）。在Fe2+质量浓度为1~10 mg/L范围内，纸基芯片检测Fe2+的线性方程为y=1.9x+1.8，线性相关系数R2为0.9940（n=3）。此外，纸基芯片的检测下限可达0.4 mg/L，满足了国家标准GB 5749—2006对生活饮用水中铁离子限量0.5 mg/L的检测要求。

图 4  S50纸基芯片检测Fe2+比色结果

Fig. 4  Colorimetric readout of Fe2+ detection by S50 paper-based chip

本研究进一步测试了样品中含有干扰离子Cu2+、Ni2+、Ca2+、Na+、Cl-对Fe2+检测的影响，结果如图5所示。从图5(a)可知，在选择性实验中，使用邻菲啰啉分别对单一离子进行检测（各离子质量浓度均为100 mg/L），结果表明，该方法对Fe2+的检测具有特异性。抗干扰实验中，在Fe2+溶液中加入10倍质量浓度的干扰离子（其中Fe2+质量浓度为10 mg/L，干扰离子质量浓度为100 mg/L），检验干扰离子的加入对颜色强度的影响，结果发现Fe2+的检测结果偏差<10%，表明该方法具有良好的抗干扰性，结果如图5(b)所示。

图 5  干扰离子对Fe2+检测的影响

Fig. 5  Influence of interfering ions on the detection of Fe2+

本研究还对饮用水样进行加标回收率的测定，取纯净水适量，在纯净水中加入已知质量浓度的Fe2+标准溶液，充分混合均匀，然后使用纸基芯片测定纯净水中Fe2+含量（n=3），结果见表2。从表2可以发现，3种质量浓度的加标回收率分别为97.2%、104.9%和108.8%，该方法测定结果与已知信息吻合度良好。

表 2  饮用水样中Fe2+检测
Table 2  Determination of Fe2+ in drinking water samples
样本原始质量浓度/mg·L-1加标质量浓度/mg·L-1检测质量浓度/mg·L-1回收率/%
纯净水 未检测出 2.5 2.4±0.5 97.2
5.0 5.2±1.2 104.9
10.0 10.9±0.4 108.8

3 结论

本研究以漂白硫酸盐松叶木浆为原料，制备纸基芯片原纸，主要探究了纸张结构对纸基芯片比色均匀性的影响。

3.1 本研究制备的实验室原纸（S50），通过磨浆促使其纤维发生分丝帚化，增强纤维间的结合力。与Whatman 1级定性滤纸（1#）相比，S50具有较为紧密的纸张结构。

3.2 与1#纸基芯片相比，S50纸基芯片降低了流体在纸张中的毛细流速，有效弱化了“咖啡环”效应的影响。在Fe2+比色检测中，S50纸基芯片颜色强度的相对标准偏差较1#纸基芯片下降63.6%，成功提高了比色检测的颜色均匀性。

3.3 S50纸基芯片表现出良好的分析响应性能，在1~75 mg/L范围线性相关良好，检测下限为0.4 mg/L，达到了国家标准对饮用水的相关要求。

本研究体现出造纸工艺技术在纸基芯片比色检测中的应用前景，对于进一步系统性研究纸张结构在其他小分子质量物质检测体系中的影响具有借鉴价值。

参 考 文 献

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