摘要
本研究以木质素磺酸钠为主要助剂，考察其对经金属氯盐预处理的桉木粉在高固体系纤维素酶水解中的影响。结果表明，木质素磺酸钠的加入对高固体系的酶水解效率有较大促进作用，当木质素磺酸钠加入量为0.4%时，酶水解效率可达93.72%，与未添加样相比，酶水解效率提高了12.5个百分点。为进一步提高酶水解效率，将木质素磺酸钠分别与CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和吐温80两种表面活性剂复配，结果表明，表面活性剂复配对高固体系的酶水解效率均有协同促进作用；当m(CTAB)∶m(木质素硫酸钠)为1.5∶1时，酶水解效率可达99.56%；m(吐温80)∶m(木质素磺酸钠)为1∶1时，酶水解效率为99.98%，纤维素基本可完全水解为还原糖。
木质纤维素是植物光合作用形成的天然高分子有机复合物，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。因其价格低廉，来源广泛、且可生物降解等特点，是生产第三代燃料乙醇最理想的原料。
木质纤维素生物炼制生产燃料乙醇过程通常包括预处理、水解、发酵、蒸馏等单元操作。其中纤维素水解为可发酵糖是纤维素乙醇炼制过程中至关重要的环节。一直以来关于木质纤维原料酶水解的报道主要集中在基于木质纤维原料物理化学结构和纤维素酶两方面。木质纤维素原料本身的结构特点决定了其与纤维素酶的结合有一定限制，包括纤维素的聚合
木质素磺酸钠是一种阴离子表面活性剂，由于磺酸的离子化而带负电荷，其相对分子质量介于200~10000之间，是纸浆生产的副产品。在木质纤维素的酶解过程中，木质素磺酸钠可以吸附在木质素表面并形成空间位阻和水合膜，从而可降低纤维素酶对木质素的非生产性吸收，进一步增强木质纤维素的酶水解效
本研究将木质素磺酸钠引入到高固体系的纤维素酶水解中，考察木质素磺酸钠加入量对酶水解的影响，并将木质素磺酸钠与其他类型的表面活性剂复配，改善高固体系的流变性和纤维素酶的假性吸附，进一步提高纤维素酶水解效率。
桉木片，购自广西金桂纸业；将桉木片用植物粉碎机磨粉后取40~60目，平衡水分后备用。纤维素酶（C2730）和纤维二糖酶（C6105），生物试剂，均购自Sigma-Aldrich公司；木质素磺酸钠，分析纯，购自国药集团；其他化学药品均为分析纯。
桉木粉预处理条件为：氯化镁浓度0.2 mol/L，固液比1∶10，温度170℃，保温时间20 min。反应所得预处理固体用去离子水洗涤至中性，并平衡水分，其中纤维素、半纤维素、木质素含量分别为：58.20%、4.33%和34.21%。
准确称取已预处理的10.00 g（±0.1 g）绝干桉木粉，置于250 mL锥形瓶中，加入一定量的0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值为4.8），配成底物浓度为10%（w/V）的悬浮液，并加入不同量的表面活性剂。然后向反应体系中加入纤维素酶（15 FBU/g）及纤维二糖酶（18.75 CBU/g），并加入1滴乙酸乙酯，用于防止水解过程中微生物及杂菌的产生。将上述样品放置于恒温培养振荡器中，于50℃下反应72 h，期间振荡器的转速保持在150 r/min。反应结束后，将反应物在90℃水浴中加热10 min，对纤维素酶进行灭活处理。酶解混合物经真空过滤后得酶解液及固体残渣。
对酶解液中的还原糖含量进行测定，其中酶解过程中的还原糖转化率（酶水解效率）计算见
| （1） |
式中，YRSc为酶水解效率，%；mRS为酶水解液中还原糖质量，mg；mc0为生物质中纤维素的绝干质量，mg；n为稀释倍数；C为水解液中的还原糖含量，mg/mL；V为水解液体积，mL。
图1 木质素磺酸钠加入量对酶水解效率的影响
酶水解时间是影响葡萄糖得率的重要因素。木质素磺酸钠的加入是否会缩短酶水解的时间需要做进一步验证。
图2 木质素磺酸钠对不同反应时间下酶水解效率的影响
由
pH值是纤维素酶水解的关键影响因素，
图3 木质素磺酸钠对不同pH值下酶水解效率的影响
由
酶水解固体底物浓度越高，水解液中葡萄糖的浓度就会相应增加，从而可降低后续发酵的成本。然而底物浓度越高，体系流变性会相应降低，从而酶与底物中纤维素的接触点可能会降低、体系中聚集的过量葡萄糖也会对酶水解产生抑制作用，因此在现有条件下控制底物浓度是达到最大转化率的关键。本实验设定反应体系pH值5.0、木质素磺酸钠加入量0.4%、反应72 h，反应温度50℃，考察木质素磺酸钠对不同浓度固体底物酶水解的影响，结果见
图4 木质素磺酸钠对不同底物浓度下酶水解效率的影响
如
通过上述2.1中的分析，木质素磺酸钠作为一种阴离子性表面活性剂，对MgCl2预处理固体基质的高固体系酶水解有明显的促进作用。但当pH值较低时，木质素由于羧基离子的作用而带负电荷，木质磺酸盐也带负电荷，两者之间存在静电斥力，从而进一步降低了木质磺酸盐对木质素的吸附。同时，木质磺酸盐形成的空间位阻不足以有效降低纤维素酶对木质素的无效吸附。因此，笔者考察了木质素磺酸钠与阳离子表面活性剂（十六烷基三甲基溴化铵，CTAB）和非离子表面活性剂（吐温80）复配对改善高固体系的酶水解效率的作用效果。
为考察CTAB与木质素磺酸钠复配对酶水解的影响，本实验在反应体系中加入相同量（0.4%）的木质素磺酸钠，并按照m(CTAB)∶m(LS)=0.05∶1~3∶1的比例加入CTAB，酶解反应体系的pH值5.0，反应时间48 h，底物浓度10%，反应温度50℃，研究表面活性剂复配对酶水解效率的影响。
图5 CTAB与木质素磺酸钠的质量比对酶水解效率的影响
为考察吐温80与木质素磺酸钠复配对酶水解的影响，在反应体系中加入相同量（0.4%）的木质素磺酸钠，并按照质量比m(吐温80)∶m(LS)= 0.05∶1~1.5∶1加入吐温80，酶解反应体系的pH值5.0，反应时间48 h，底物浓度10%，反应温度50℃，研究表面活性剂复配对酶解效率的影响。
图6 吐温80与木质素磺酸钠的质量比对酶水解效率的影响
本研究以木质素磺酸钠为主要助剂，考察其对经金属氯盐预处理的桉木粉在高固体系纤维素酶水解中的影响。
3.1 木质素磺酸钠作为阴离子表面活性剂，可促进高浓度固体基质的流动性，防止纤维素酶与底物中木质素的“无效吸附”，可显著提高高固体系纤维素酶水解的效率，降低生产成本。
3.2 在酶水解体系中添加0.4%的木质素磺酸钠，酶水解效率可达93.72%，比未添加样品提高了12.50%；并且底物浓度越大，木质素磺酸钠对酶水解效率的优化作用越大，当底物浓度为17%时，添加木质素磺酸钠，可将酶水解效率提高13.0个百分点。
3.3 将木质素磺酸钠分别与CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和吐温80两种表面活性剂复配，结果表明，表面活性剂复配对高固体系的纤维素酶水解效率均有协同促进作用；当m(CTAB)∶m(木质素磺酸钠)为1.5∶1时，酶水解效率可达99.56%；当m(吐温80)∶m(木质素磺酸钠)为1∶1时，酶水解效率为99.98%，纤维素基本可完全水解为还原糖。
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