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聚木糖酶处理桉木预水解液制备低聚木糖的研究

  • 陈嘉川
  • 董吉冉
  • 杨桂花
  • 徐丰
  • 吉兴香
齐鲁工业大学（山东省科学院）生物基材料与绿色造纸国家重点实验室/ 制浆造纸科学与技术教育部重点实验室，山东济南，250353

中图分类号： TS79； TS244

发布日期：2019-08-20

DOI：10.11980/j.issn.0254-508X.2019.08.001

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EN 引
目录contents

摘要

以桉木预水解液为原料，首先采用Ca(OH)2和活性炭处理制备二级处理预水解液，然后采用聚木糖酶酶解制备低聚木糖。探讨了处理过程中聚木糖酶用量、处理时间、处理温度和pH值对二级处理预水解液中聚合度为2~4的低聚木糖（低聚木糖DP2~4）含量的影响，并对所制备的低聚木糖产品进行分析与表征。结果表明，聚木糖酶处理桉木预水解液制备低聚木糖的较优工艺条件为：聚木糖酶用量2 U/g、处理时间 3 h、处理温度55℃和处理液pH值5.5，在此条件下，经酶处理后所得三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4含量为12.22 g/L，与未经过酶处理的二级处理预水解液相比，低聚木糖DP2~4含量提高了67.2%；经过酶处理后三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4含量占桉木预水解液中总木糖含量的56.1%。红外光谱（FT-IR）和热重分析（TGA）表明，经过聚木糖酶处理预水解液所制备的低聚木糖中含有部分糖醛酸侧链，且具有较高的热稳定性。

低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）又称木寡糖，是一种由木糖分子通过β-1,4糖苷键连接而成的功能性低聚糖，其主要成分为木二糖、木三糖和木四糖的混合物[

1]。低聚木糖具有较好的理化性质，例如选择性增殖肠道益生菌[2]；降低胆固醇、提高钙的生物利用度[3]；抗氧化、抗菌、增强免疫力、改善心血管系统[4]；可满足糖尿病人及肥胖症人对甜度的需求 [5,6]等。因此，低聚木糖被认为是目前最有前景的功能性低聚糖之一，广泛应用于食品及医药行业[7]。

目前国内外生产低聚木糖的方法主要有自水解、酸水解、微波降解法和酶水解[

6]。自水解方法操作简单、无污染，但是对设备要求较高，精制过程繁琐，且产物得率和纯度较低。酸水解方法过程简单，反应迅速，但是对设备要求高、反应过程不易控制、产物得率低、有毒副产物含量高[8]。微波降解法加热方式简单方便，具有加热速率快、可选择性加热、对热能消耗量少及反应副产物少、所得产物纯度高等优点，但多局限于实验室研究阶段[9]。酶水解主要是利用内切聚木糖酶选择性切割木糖单元间的糖苷键。该方法条件温和、对设备无特殊要求、易于控制，且制备过程不产生有毒副产物，制备所得低聚木糖产品纯度较高，是一种清洁环保型低聚木糖制备工艺[10]。

据报道，目前市场上的低聚木糖大多是由玉米芯、麦麸等农林废弃物生产而来[

6,11]。由于这些原料所含杂质较多，因此精制工艺较为繁琐，生产成本高，使低聚木糖产品价格较高，限制了其在普通食品中的扩大应用[7]。近年来，随着溶解浆市场需求量的不断提高，预水解液作为溶解浆生产过程中的副产物其产量日益增加[12,13]。预水解液中含有大量的半纤维素，部分企业将预水解液与黑液混合燃烧产生热量，降低了资源利用率[14,15]。阔叶木预水解液中的半纤维素糖类主要是低聚木糖和聚木糖，因此是生产低聚木糖的良好资源[16,17]。利用预水解液生产低聚木糖不仅可以为企业带来额外的利润收入，同时可以丰富低聚木糖的生产途径，符合生物质精炼的要求。

本研究以桉木预水解液为原料，首先采用Ca(OH)2、活性炭对预水解液进行纯化，制备得到二级处理预水解液，然后通过聚木糖酶处理制备富含木二糖～木四糖的三级处理预水解液，探讨聚木糖酶处理过程中不同因素对三级处理预水解液中低聚木糖含量的影响，并对所制备的低聚木糖产品进行分析与表征，为预水解液中半纤维素的高值化利用提供理论指导。

1 实 验

1.1　材料及试剂

桉木预水解液，山东太阳纸业有限公司提供。

Ca(OH)2，分析纯，天津恒兴试剂有限公司；活性炭，磷酸活化、木质、过200目，广东海燕活性炭有限公司；聚木糖酶，酶活70000 U，山东隆科特酶制剂公司；KBr，光谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；液体NaOH，色谱纯、纯度50%，美国Thermo-Fisher公司；木糖、木二糖、木三糖及木四糖，标准品，上海意果科技有限公司；透析袋：MD34、200 Da，美国迈姆生物科技有限公司；商品低聚木糖，食品级，XOS-95，购于山东龙力公司。

1.2　实验方法

1.2.1　桉木二级处理预水解液的制备

向桉木预水解液中加入用量1%（以预水解液质量计）的Ca(OH)2，以150 r/min的转速搅拌处理30 min，后置于离心机中以4500 r/min的转速离心3 min，取上清液，称为一级处理预水解液；向一级处理预水解液中加入用量0.8%（以一级处理液质量计）的活性炭，吸附10 min后离心（4500 r/min）3 min，取上层清液，称为二级处理预水解液。各级处理预水解液中木素、木糖、乙酸和糠醛的含量如表1所示。从表1可知，经过Ca(OH)2和活性炭处理后，预水解液中木素脱除率较高为80.3%，糠醛完全脱除，总木糖损失率较低为9.6%。另外，Ca(OH)2处理使聚木糖侧链上连接的乙酰基脱落下来形成乙酸，从而提高了水解液中的乙酸含量。二级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4的含量如表2所示。

表 1 各级预水解液化学成分分析g/L
预水解液木素木糖聚木糖总木糖乙酸糠醛
桉木预水解液 6.65 5.87 16.87 22.74 4.33 1.07
一级处理预水解液 3.39 5.69 16.57 22.26 7.95 0.39
二级处理预水解液 1.31 5.45 15.10 20.55 7.58 0
表 2 二级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量g/L
木糖木二糖木三糖木四糖低聚木糖DP2~4
5.45 2.73 2.22 2.36 7.31
注：

注   低聚木糖DP2~4为木二糖、木三糖和木四糖含量的总和，下同。

1.2.2　聚木糖酶处理制备三级处理预水解液

向50 mL锥形瓶中各加入20 g二级处理预水解液，分别加入用量为2、5、10、20 U/g的聚木糖酶，将锥形瓶置于恒温摇床中，以150 r/min的转速摇晃处理，探究处理时间（0.67、1、2、3、6、18 h）、处理温度（45、55、60℃）和pH值（4.5、5.5、6.5）对三级处理预水解液中木糖和低聚木糖DP2~4含量的影响。反应完成后，将三级处理预水解液置于沸水浴中处理10 min使聚木糖酶灭活，后置于离心机中以4500 r/min的转速离心3 min，收集上清液用于木糖及低聚木糖DP2~4含量的检测。

1.2.3　低聚木糖的纯化

将聚木糖酶处理后的三级处理预水解液置入透析袋中透析处理48 h，以除去其中剩余的小分子木素等杂质。透析完成后，将透析液进行旋转蒸发除去部分水分，然后将浓缩糖液进行冷冻干燥得到低聚木糖产品，用于后续分析与表征。

1.3　检测与分析

1.3.1　预水解液中木糖、低聚木糖及总木糖含量的检测

取1 mL预水解液稀释适宜倍数，采用离子色谱仪（ICS-5000型，美国Thermofisher公司），以Dionex CarboPacTM PA200（3 mm × 250 mm）为分析柱，以CarboPacTM PA200（3 mm × 50 mm）为保护柱，柱温30℃，取样25 μL，采用100 mmol/L NaOH与500 mmol/L NaOAc溶液，以0.3 mL/min的流速梯度淋洗，测定预水解液中木糖、木二糖、木三糖、木四糖的含量。

预水解液中总木糖含量的检测：取5 mL预水解液放入耐压瓶中，加入174 μL、质量分数为72%的H2SO4，将耐压瓶密封后放入油浴中，121℃下反应60 min，然后取上清液稀释适宜倍数，按上述方法测定预水解液中的木糖含量，即为预水解液中的总木糖含量。

1.3.2　红外光谱（FT-IR）分析

取1 mg经过冷冻干燥后得到的低聚木糖样品，与100 mg干燥的KBr经玛瑙研钵研磨后压片，置于Vertex70傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）（Vertex70型，德国布鲁克公司）中测试，扫描范围为250~4250 cm－1，扫描次数为16次。

1.3.3　热稳定性（TGA）分析

取5~10 mg经过冷冻干燥后得到的低聚木糖样品置于坩埚中，在热重分析仪（Q50型，美国TA仪器公司）中进行测试。测试条件:以高纯度氮气（≥99.99%）为载气，流量为60 mL/min，以10℃/min的升温速率从室温升温至600℃。

2 结果与讨论

2.1　酶用量及处理时间对三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响

聚木糖酶处理过程中酶用量及处理时间对三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响见图1。由图1中数据可知，酶用量及处理时间对三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4含量的影响较大，而对木糖含量影响较小。图1(a)显示，在酶用量为2 U/g时，随着处理时间的延长，三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4的含量呈现先快速增加后逐渐不变的趋势，原因可能是酶用量较低时，预水解液中酶分子数量较少，随着处理时间的延长，酶分子与反应底物不断结合，在处理时间为3 h时，几乎所有的酶分子与反应底物结合，此时预水解液中低聚木糖DP2~4含量较高为12.22 g/L；之后，由于预水解液中剩余的酶分子数量更少，因此进一步延长处理时间低聚木糖含量变化不明显。由图1(b)、图1(c)可知，在酶用量为5 U/g、10 U/g时，随着处理时间的延长，三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4含量呈现先增加后降低的趋势，而且分别在处理6 h和3 h时达到最大值，分别为13.02 g/L和13.12 g/L。这是由于随着处理时间的延长，预水解液中的聚木糖不断被降解为低聚木糖，在处理时间分别为6 h和3 h时，几乎所有的聚木糖转化为低聚木糖，此时，预水解液中木糖和低聚木糖DP2~4总量分别为18.84 g/L和19.08 g/L；由于预水解液中剩余的聚木糖含量较少，因此进一步延长处理时间，预水解液中剩余的大量酶分子会进一步切割低聚木糖的糖苷键形成木糖，这和预水解液中木糖含量的提高是一致的。图1(d)中数据表明，在酶用量为20 U/g时，酶处理0.67 h即可使预水解液中的低聚木糖DP2~4含量达到最大值13.1 g/L；进一步延长处理时间，低聚木糖含量不断降低。这是由于酶用量较高时预水解液中的酶分子数量较高，酶分子与反应底物结合的机率增加。因此，较短的处理时间内酶分子即可与反应底物充分结合，有效提高了聚木糖水解生产低聚木糖DP2~4的反应速度。由以上分析可知，低酶用量和长处理时间或者高酶用量和短处理时间均可使低聚木糖DP2~4含量达到较高值。因此，考虑到实际生产成本，较优的聚木糖酶用量为2 U/g，酶处理时间为3 h。

图1 酶用量及处理时间对三级处理预水解中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响

注：

处理温度55℃，二级处理预水解液pH值5.5。

2.2　处理温度对三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响

聚木糖酶处理过程中处理温度对三级处理预水解液中木糖和低聚木糖DP2~4含量的影响见图2。图2中数据表明，温度是影响酶处理效果的重要因素。在处理温度为45℃时，预水解液中低聚木糖DP2~4含量较低，这是由于温度较低时聚木糖酶活性较低，酶反应速率较慢。升高处理温度至55℃，预水解液中低聚木糖DP2~4含量快速提高至12.22 g/L，此时预水解液中木糖、木二糖、木三糖及木四糖含量分别为5.53、5.69、4.15和2.38 g/L，原因是升高处理温度使反应体系中的酶分子与聚木糖分子运动加快，增加了二者之间的碰撞机会，有效地提高了酶分子-聚木糖底物络合物转变为低聚木糖的速度。之后，进一步升高处理温度至60℃，预水解液中低聚木糖DP2~4的含量快速降低，这是由聚木糖酶自身的性质造成的，聚木糖酶是一种具有特殊催化活性的蛋白质，在温度较高时酶蛋白的构象与参与酶促反应的功能团的离解状态会发生改变，使酶分子活力降低或发生失活[

17]。因此，利用聚木糖酶水解制备低聚木糖时需要严格控制处理温度。综上分析，较优的聚木糖酶处理温度为55℃。

图2 处理温度对三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响

注：

酶用量2 U/g，处理时间3 h，二级处理预水解液pH值5.5。

2.3　酶解pH值对三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响

聚木糖酶处理过程中pH值对三级处理预水解液中木糖和低聚木糖DP2~4含量的影响见图3。

图3 pH值对三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量的影响

注：

酶用量2 U/g，处理时间3 h，处理温度55℃。

由图3中数据可知，随着三级处理预水解液pH值的不断增加，低聚木糖DP2~4含量呈现先增加后降低的趋势，这是由于pH值可以通过改变聚木糖酶的构象进而影响酶的活性位点与底物的结合。在pH值为4.5或6.5时，聚木糖酶的构象与参与酶反应的功能团的离解状态发生了改变，使得聚木糖酶活力下降，因此，过低或过高的pH值环境均不适合聚木糖酶水解制备低聚木糖。另外，图3显示，pH值对预水解液中木糖含量的影响较小，这是由于内切聚木糖酶可以选择性地切割聚木糖主链的β-1,4糖苷键。由以上分析可知，聚木糖酶处理二级处理预水解液制备低聚木糖DP2~4的较优pH值为5.5。

2.4　较优处理工艺条件下不同聚合度低聚木糖DP2~4含量分布

由上述2.1~2.3分析可知，聚木糖酶处理二级处理预水解液制备富含低聚木糖DP2~4的较优工艺条件为聚木糖酶用量2 U/g、处理时间3 h、处理温度55℃、处理液pH值5.5。在此条件下，三级处理预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4的含量如表3所示。

表3 聚木糖酶处理前后预水解液中木糖及低聚木糖DP2~4含量g/L
预水解液木糖木二糖木三糖木四糖低聚木糖DP2~4
二级处理预水解液 5.45 2.73 2.22 2.36 7.31
三级处理预水解液 5.53 5.69 4.15 2.38 12.22

由表3中数据可知，聚木糖酶处理对三级处理预水解液中木糖含量的影响较小，而对低聚木糖DP2~4含量的影响较大。经过聚木糖酶处理后，预水解液中木二糖及木三糖含量分别提高了108.4%、86.9%，而木四糖含量变化不明显，低聚木糖DP2~4含量由原来的7.31 g/L提高为12.22 g/L，提高了67.2%。在较优的酶处理条件下，所得三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4的含量占原始桉木预水解液中总木糖含量的56.1%。由以上分析可知，利用聚木糖酶处理桉木预水解液是制备低聚木糖较为有效的方法。

2.5　FT-IR分析

预水解液经过聚木糖酶处理后所得酶解低聚木糖和商品低聚木糖样品的FT-IR图如图4所示。由图4可知，两种低聚木糖样品均在1045、894和1408 cm－1处出现特征吸收峰。样品在1045 cm－1处出现较强的吸收峰，是由C—O的伸缩振动引起，是聚木糖主链的特征吸收峰[

18]；894 cm－1处出现的吸收峰是由糖单元间显性β-糖苷键的振动引起；1635 cm－1处的吸收峰是由吸附水的弯曲振动引起[19]；1408 cm－1处出现的吸收峰是由—COO－的对称伸缩振动引起，为糖醛酸的典型特征峰[20]，这表明经过聚木糖酶处理所制备的低聚木糖产品中含有部分糖醛酸侧链。另外图4显示，酶解低聚木糖在1730 cm－1处没有出现特征吸收峰，这是由于Ca(OH)2处理纯化预水解液过程中，碱性条件下聚木糖侧链上的乙酰基脱落造成的[21]。

图4 聚木糖酶处理所制备的酶解低聚木糖和商品低聚木糖样品的FT-IR图

注：

酶解低聚木糖由三级处理预水解液经透析、冷冻干燥后得到。

2.6　TGA分析

聚木糖酶处理所制备的酶解低聚木糖和商品低聚木糖样品的TGA图如图5所示。由图5中TG曲线和DTG曲线可知，酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA图相似。两种低聚木糖在160℃前只发生脱水，从190℃开始发生分解，并在310℃出现最大质量损失峰，质量损失过程在600℃完成，之后质量损失变化不明显。由以上分析可知，酶解所得低聚木糖热降解过程主要分为4个阶段：160℃前为第一阶段，样品吸热使样品中的水分蒸发，这一阶段只发生物理变化；160~310℃为第二阶段，在此阶段内低聚木糖出现解聚转变现象，生成不燃性气体如CO、CO2、甲酸和乙酸等[

18]；310~440℃为第三阶段，在此阶段内，不燃性气体生成为可燃性气体[19]；440℃后为第四阶段，该阶段主要发生炭化反应，是由C—O和C—H键的进一步裂解造成的[22]。由上述分析可知，利用聚木糖酶处理预水解液所制备的低聚木糖样品具有较高的热稳定性。

图5 聚木糖酶处理所制备的酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA分析

注：

酶解低聚木糖由三级处理预水解液经透析、冷冻干燥后得到。

3 结　论

采用单因素实验对聚木糖酶处理二级处理预水解液制备富含低聚木糖DP2~4的工艺参数进行了优化分析，并得出以下结论。

3.1 聚木糖酶用量、处理时间、处理温度及pH值对预水解液中低聚木糖DP2~4的含量均有较大影响；低酶用量和长处理时间或者高酶用量和短处理时间均可使低聚木糖DP2~4的含量达到较高值；聚木糖酶处理预水解液制备低聚木糖DP2~4的较优工艺条件为酶用量2 U/g、处理时间3 h、处理温度55℃和pH值5.5，在此条件下，经过酶处理后三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4含量为12.22 g/L，与未经过酶处理的二级处理预水解液相比，低聚木糖DP2~4含量提高了67.2%。三级处理预水解液中低聚木糖DP2~4含量为桉木预水解液中总木糖含量的56.1%。

3.2 红外光谱（FT-IR）分析表明，通过聚木糖酶处理桉木预水解液所制备的低聚木糖含有部分糖醛酸侧链；热重分析（TGA）显示，经过聚木糖酶处理制备的低聚木糖具有较高的热稳定性。

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